内容

·食品微生物学检验 总则

·食品微生物学检验 菌落总数测定

·食品微生物学检验 大肠菌群计数

·熟肉制品 GB2726-2016 微生物限量

 

 

一、范围:

本标准规定了食品微生物学检验基本原则和要求。

本标准适用于食品微生物学检验。

二、实验室基本要求:

1、检验人员 

2、环境与设施

3、实验设备

4、检验用品

5、培养基和试剂

6、质控菌株

 

二、实验室基本要求:

 

1、检验人员

.应具有相应的微生物专业教育或培训经历，具备相应的资质，能够理解并正确实施检验。

.应掌握实验室生物安全操作和消毒知识。

.应在检验过程中保持个人整洁与卫生，防止人为污染样品

.应在检验过程中遵守相关安全措施的规定，确保自身安全

.有颜色视觉障碍的人员不能从事涉及辨色的实验。

 

2、环境与设施

①、实验室环境不应影响检验结果的准确性。

②、实验区域应与办公区域明显分开。

③、实验室工作面积和总体布局应能满足从事检验工作的需要,实验室布局宜采用单方向工作程,避免交叉污染。

④. 实验室内环境的温度、湿度、洁净度及照度、噪声等应符合工作要求。

⑤、食品样品检验应在洁净区域进行,洁净区域应有明显标示。

⑥、病原微生物分离鉴定工作应在二级或以上生物安全实验室进行。

 

3、实验设备

.实验设备应满足检验工作的需要，常用设备见A.1。

.实验设备应放置于适宜的环境条件下，便于维护清洁、消毒与校准，并保持整洁与良好的工作状态。

.实验设备应定期进行检查和/或检定(加贴标识)维护和保养，以确保工作性能和操作安全。

.实验设备应有日常监控记录或使用记录。

 

4、检验用品

.检验用品应满足微生物检验工作的需求，常用检验用品见A.2

.检验用品在使用前应保持清洁和/或无菌。

.需要灭菌的检验用品应放置在特定容器内或用合适的材料(如专用包装纸、铝箔纸等)包裹或加塞，应保证灭菌效果。

.检验用品的储存环境应保持干燥和清洁，已灭菌与未灭菌的用品应分开存放并明确标识。

.灭菌检验用品应记录灭菌的温度与持续时间及有效使用期限。

 

5、培养基和试剂

培养基和试剂的制备和质量要求按照GB4789.28的规定执行。

 

6、质控菌株

.实验室应保存能满足实验需要的标准菌株。

.应使用微生物菌种保藏专门机构或专业权威机构保存的、可溯源的标准菌株。

.标准菌株的保存、传代按照GB4789.28的规定执行。

.对实验室分离菌株(野生菌株)，经过鉴定后，可作为实验室内部质量控制的菌株

 

三、样品的采集:

1、采样原则：

.样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。

.采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。

 

2、采样方案

2.1、根据检验自的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确

定采样方案

 

2.2.采样类型

.二级采样方案设有n、c和m值

.三级采样方案设有n、C、m和M值

n:同一批次产品应采集的样品件数

c:最大可允许超出m值的样品数。

m:微生物指标可接受水平的限量值(三级采样方案)或最高安全限值(三级采样方案)

M:微生物指标的最高安全限量值

.注1:二级采样方案在n个样品中

允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值大于m值

.注2:三级采样方案在n个样品中

.允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值;

.允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间;

.不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。

按采样方案的结果判定

按三级采样方案设定的指标:n=5，c=2,m= 100CFU/g,，M= 1000CFU/g

.若5个样品的检验结果均小于或等于m值(≤100CFU/g)  √

.若≤2个样品位于m和M之间(100CFU/g<x≤1000CFU/g)  √ 

.若3个及以上样品的检验结果位于m值和M值之间     X

.若有任一样品的检验结果大于M值(> 1000CFU/g )    X

 

2.3、各类食品的采样方案按食品安全相关标准的规定执行。

 

2.4、食品安全事故中食品样品的采集:

a)由批量生产加.工的食品污染导致的食品安全事故，食品样品的采集和判定原则按第2条和第3条执行，重点采集同批次食品样品。

b)由餐饮单位或家庭烹调加工的食品导致的食品安全事故重点采集现场剩余食品样品,以满足食品安全事故病因判定和病原确证的要求。

 

3、各类食品的采样方法

①、预包装食品

.应采集相同批次、独立包装、适量件数的食品样品，每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求。

.独立包装小于、等于1000g的固态食品或小于、等于1000mL的液态食品，取相同批次的包装。

.独立包装大于1000mL的液态食品,应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后采集适量样品,放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品；大于1000g的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品。

 

②、散装食品或现场制作食品:

用无菌采样工具从n个不同部位现场采集样品,放入n个无菌采样容器内作为n件食品样品。每件样品的采样量应满足微生物指标检验单位的要求。 

 

4、采集样品的标记 

应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记,内容包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、 批号、数量、保存条件等信息。 

 

5、采集样品的贮存和运输

.应尽快将样品送往实验室检验。

.应在运输过程中保持样品完整。

. 应在接近原有贮存温度条件下贮存样品,或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化。 

 

四、检验:

1、样品处理 

1.1 实验室接到送检样品后应认真核对登记,确保样品的相关信息完整并符合检验要求。 

1.2 实验室应按要求尽快检验。若不能及时检验,应采取必要的措施,防止样品中原有微生物因客 观条件的干扰而发生变化。 

1.3 各类食品样品处理应按相关食品安全标准检验方法的规定执行。

 

2 样品检验 

按食品安全相关标准的规定进行检验。 

五、生物安全与质量控制 :

1、实验室生物安全要求 

应符合 GB19489的规定。

 

2、质量控制 

. 实验室应根据需要设置阳性对照、阴性对照和空白对照,定期对检验过程进行质量控制。

. 实验室应定期对实验人员进行技术考核。 

 

六、记录与报告 :

 

1、记录 

检验过程中应即时、客观地记录观察到的现象、结果和数据等信息。 

2、报告 

实验室应按照检验方法中规定的要求,准确、客观地报告检验结果。 

七、检验后样品的处理 :

.检验结果报告后,被检样品方能处理。 

.检出致病菌的样品要经过无害化处理。

.检验结果报告后,剩余样品和同批产品不进行微生物项目的复检。

 

 

 

 

 

 

1 范围

本标准规定了食品中菌落总数(Aerobicplatecount)的测定方法。

本标准适用于食品中菌落总数的测定。

 

2术语和定义

 

3  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。

 

3.2 冰箱：2℃~5℃。

3.4 天平：感量为0.1g。3.3 恒温装置：48℃±2℃。

3.5 均质器。

 

3.6 振荡器。

3.7 无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。

3.8 无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。

3.9 无菌培养皿：直径90mm。

3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

3.11 放大镜或/和菌落计数器。加一个试管和配套试管塞（尺寸15*150mm）

 

4  培养基和试剂

 

4.1 平板计数琼脂培养基

4.2 菌落总数测试片

4.3 磷酸盐缓冲液

4.4 无菌生理盐水

 

5  检验程序

菌落总数的检验程序见图1。

 

 

 

6  操作步骤

6.1  样品的稀释

6.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，制成1∶10的样品匀液。

 

6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

 

6.1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

 

6.1.4 按6.1.3操作，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

 

6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择1个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

 

6.1.6 及时将15mL~20mL冷却至46℃~50℃的平板计数琼脂培养基(可放置于48℃±2℃恒温装置如：恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

 

6.2  培养

6.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL)，凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。

 

6.2.2 如使用菌落总数测试片,应按照测试片所提供的相关技术规程操作。

 

6.3  菌落计数

6.3.1 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits，CFU)表示。

 

6.3.2  选取菌落数在30 CFU~300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

 

6.3.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

 

6.3.4 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

 

7  结果与报告

 

7.1 菌落总数的计算方法

 

7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)样品中菌落总数结果。

 

7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(1)计算：

 

7.1.3 若所有稀释度的平板菌落数均＜30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

 

7.1.4 若所有稀释度的平板上菌落数均＞300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

 

7.1.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

 

7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU 之间,其中一部分＜30CFU 或＞300CFU 时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

 

7.2 菌落总数的报告

7.2.1 菌落数小于100CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。

 

7.2.2 菌落数大于或等于100CFU 时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用 0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。

 

7.2.3 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。

 

7.2.4 称重取样以 CFU/g为单位报告,体积取样以 CFU/mL为单位报告。

 

 

 

 

 

一、范围

本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。 

本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较 高的食品中大肠菌群的计数。 

 

二、术语和定义 

1 大肠菌群 Coliforms 

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

 

2 最可能数 Mostprobablenumber

MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 

 

三、检验原理 

1、MPN法

MPN 法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

 

2、平板计数法 

大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。

 

四、设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 

.恒温培养箱:36 ℃ ±1 ℃

.冰箱:2 ℃~5 ℃

.恒温水浴箱:46℃±1℃

.天平:感量 0.1g 

.均质器

.振荡器

.无菌吸管:1mL(具 0.01mL 刻度)、10mL(具 0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头 

.无菌锥形瓶:容量500mL

.无菌培养皿:直径 90mm

.pH 计或 pH 比色管或精密pH 试纸

.菌落计数器

 

五、培养基和试剂 

.月桂基硫酸盐胰蛋白胨(laurylsulfatetryptose,LST)肉汤

.煌绿乳糖胆盐(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉汤

.结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,VRBA)

.无菌磷酸盐缓冲液

.无菌生理盐水

.1mol/LNaOH 溶液

 

 

 

 

 

第一法：大肠菌群 MPN计数法 

 

一、检验程序

二、操作步骤

1、样品的稀释 

 

①固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。

 

②液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。

 

③样品匀液的pH 应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/L HCl调节。

 

④用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲 液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。 

 

⑤根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。 

 

2、初发酵试验

每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36 ℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

 

3、复发酵试验(证实试验) 

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中，36 ℃±1 ℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

 

4、可能数(MPN)的报告

根据确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索 MPN 表,报告每g(mL)样品中大肠菌群的 MPN 值。 

 

现行有效的16版&03版 

 

 

 

 

 

 

第二法：平板计数法 

一、检验程序：

 

1、样品的稀释 

按MPN法中的稀释方法进行

 

2、平板计数 

①选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。同时取1mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 

②及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平 皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆盖平板表 层。翻转平板,置于36 ℃±1 ℃培养18h~24h。 

 

3、平板菌落数的选择 

选取菌落数在15CFU~150CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落 (如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm 或更大,最低稀释度平板低于15CFU 的记录具体菌落数。

 

4、证实试验 

从 VRBA 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于 BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气, 即可报告为大肠菌群阳性

 

5、大肠菌群平板计数的报告 

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每 g(mL)样品中大肠菌群数。例:10^-4样品稀释液1mL,在 VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:

100×6/10×10⁴/g(mL)=6.0×10⁵CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀 释倍数计算。

 

备注: 

6.0×10⁵CFU/g(mL)也 就是600000CFU/g(mL)这个作为公司统一的数据修约后的报告方式，若均无菌落生长则报告值为<10CFU/g(mL)

例: 10^-2样品稀释液1mL，在VRBA平板上有90个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有10个阳性管,则该样品的大肠菌群数为: 90×10/10×10²/g(mL)=9000CFU/g(mL)

 

 

 

 

 

 

一、致病菌限量应符合GB29921的规定

二、微生物限量还应符合表2的规定

 

 

 

 

来自：食品微生物检测